TRAC-seq：tRNA m7G修飾測序
項目簡介
你與最前沿的m7G研究，隻差一個TRAC-seq
RNA 甲基化修飾 m7G（7- 甲基鳥嘌呤），是 tRNA 上最豐富的修飾類型之一，與 tRNA 穩定性和腫瘤等人類疾病密切 相關。TRAC-seq（m7G tRNA Reduction and Cleavage-Sequence），即 m7G tRNA 還原和斷裂測序，係基於 AlkB 去甲基化酶的 tRNA m7 G 修飾研究方法，無需抗體，高效完成單核苷酸分辨率的 tRNA m7 G 修飾圖譜繪製。
應用與優勢
技術應用
1. tRNA轉錄組全局m7G修飾定位
2. 研究METTL1-WDR4甲基化轉移酶介導的tRNA穩定性等生理機製
3. 研究腫瘤等疾病的tRNA m7 G修飾異常表達，探究疾病發生發展機製
技術優勢
1. 結合小RNA分離步驟，選取tRNA進行處理，針對性強
2. 去甲基化酶AlkB處理，極大提高tRNA反轉錄效率，獲
得完整tRNA修飾圖譜
3. 利用AlkB和NaBH4 還原步驟，無需抗體，結果無偏移、高效
4. 精確識別tRNA修飾，達到單核苷分辨率
分析內容
1. 測序原始reads去接頭，質量控製（QC）
2. 參考基因組比對（Mapping）
3. 化學剪切鑒定
4. tRNA m7 G鑒定
4.1 表達定量 4.2 差異分析
4.3 motif分析 4.4 關聯分析
技術原理
提取小 RNA，細菌去甲基化酶 AlkB 處理，去除大部分tRNA 修飾，然後 NaBH4和苯胺處理，誘導 m7 G修飾位點的 RNA 骨架的還原和斷裂。具有規則的 3’端的切割產物加上接頭，建庫測序
送樣要求
細胞，≥ 2×107 個細胞/ 樣本
樣本類型
組織，≥ 50mg/ 樣本
總RNA，≥ 100μg/ 樣本，RIN 值≥ 6
僅限人、大小鼠，其他物種需評估
樣本物種
表觀生物實測數據
參考案例
Mol Cell：m7G tRNA修飾增強致癌mRNA翻譯，促進肝內膽管癌發展[1]
該研究首先通過對 TCGA 數據庫中 22 種 tRNA 修飾酶表達分析發現，tRNA m7G 修飾相關的 METTL1 在肝內膽管癌（ICC）中表達顯著上調；通過 TRAC-seq，發現 METTL1 敲除後，ICC 中的 m7G 修飾豐度減少，其修飾的 tRNA 表達水平也明顯下降（RNA-seq）；進一步利用 Ribo-seq 發現敲除 METTL1 後，影響基因翻譯，表明 METTL1 介導的 tRNAm7 G 修飾具有調控 tRNA 水平和細胞翻譯的功能。後續深入的機製研究表明，ICC 細胞可以通過 m7 G tRNA 解碼的密碼子頻率偏倚機製，選擇性調控了包括 EGFR 信號、細胞周期在內的多種相關癌基因的翻譯，進而促進 ICC 的進展。
圖2 結構域的解析
參考文獻
[1] Dai Z, Liu H, Liao J, et al. N7-Methylguanosine tRNA modifification enhances oncogenic mRNA translation and promotes intrahepatic
cholangiocarcinoma progression. Mol Cell. 2021 Aug 19;81(16):3339-3355.e8.