蛋白相分離
一、蛋白相分離形成能力預測
蛋白相分離形成能力預測
通過生物信息學的前沿算法，可以對蛋白相分離形成能力進行一個初步的預測。
內容：利用機器學習建立的PSPHunter算法，基於蛋白氨基酸序列，整體預測蛋白相分離形成能力（賦分0.8以上為高成相能力蛋白）
二、蛋白相分離形成能力驗證
細胞中最為常見的相分離是液態相分離結構。目前相分離研究領域認為[4]，鑒定相分離，需要以下的實驗證明：
1. FRAP
2. 結構大小是否達到或接近微米級別
3. 活細胞成像
4. 體外重構
有鑒於此，表觀生物推出了以下的蛋白相分離形成能力驗證實驗服務：
免疫熒光染色檢測蛋白細胞分布
內容：通過免疫熒光染色，檢測目的蛋白的活細胞分布以及聚集情況。可同時檢測兩個蛋白的活細胞分布以及共定位情況（需要客戶提供細胞以及目的蛋白抗體）
相分離熒光載體構建
內容：
原核表達純化及蛋白體外成相實驗
2012年(nian)，美(mei)國(guo)西(xi)南(nan)醫(yi)學(xue)中(zhong)心(xin)的(de)研(yan)究(jiu)團(tuan)隊(dui)發(fa)現(xian)在(zai)試(shi)管(guan)中(zhong)分(fen)子(zi)通(tong)過(guo)微(wei)弱(ruo)的(de)作(zuo)用(yong)力(li)形(xing)成(cheng)液(ye)滴(di)，首(shou)次(ci)證(zheng)實(shi)了(le)相(xiang)分(fen)離(li)能(neng)夠(gou)通(tong)過(guo)簡(jian)單(dan)的(de)生(sheng)化(hua)實(shi)驗(yan)在(zai)體(ti)外(wai)重(zhong)複(fu)[5]。因此，相分離可以在體外通過純化的蛋白以及核酸等在特定的條件下發生，體外重構的相分離實驗對於該領域具有重要的作用。
內容：原核表達融合His-Tag以及熒光Tag的目的蛋白，經過鎳柱親和純化，獲得高純度的目的蛋白。摸索適合的體外成相條件，觀察目的蛋白的體外成相情況
蛋白融合熒光細胞係構建以及活細胞成相實驗
內容：將目的蛋白融合熒光蛋白（EGFP/RFP）真zhen核he表biao達da載zai體ti轉zhuan染ran至zhi目mu標biao細xi胞bao中zhong，經jing過guo藥yao物wu篩shai選xuan構gou建jian穩wen定ding表biao達da細xi胞bao係xi。利li用yong構gou建jian成cheng功gong的de細xi胞bao係xi進jin行xing激ji光guang共gong聚ju焦jiao活huo細xi胞bao成cheng像xiang，觀guan察cha目mu的de蛋dan白bai在zai細xi胞bao內nei成cheng相xiang情qing況kuang。
體外FRAP
熒光漂白恢複實驗（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）changyongyuceliangyedideliudongxing，kansuoyanjiudedanbaishifouzaiduanshijianneihuifuyingguang，zhekeyibiaomingcizhongjiegoushifouyuzhouweihuanjingzaijinxingpinfandewuzhijiaohuan，fuzhuyanzhengxiangfenli。
內容：蛋(dan)白(bai)在(zai)體(ti)外(wai)體(ti)係(xi)形(xing)成(cheng)相(xiang)分(fen)離(li)後(hou)，使(shi)用(yong)激(ji)光(guang)共(gong)聚(ju)焦(jiao)顯(xian)微(wei)鏡(jing)觀(guan)察(cha)相(xiang)分(fen)離(li)液(ye)滴(di)經(jing)過(guo)光(guang)漂(piao)白(bai)之(zhi)後(hou)，液(ye)滴(di)淬(cui)滅(mie)區(qu)域(yu)熒(ying)光(guang)恢(hui)複(fu)情(qing)況(kuang)，由(you)此(ci)驗(yan)證(zheng)蛋(dan)白(bai)體(ti)外(wai)相(xiang)分(fen)離(li)液(ye)滴(di)的(de)流(liu)動(dong)性(xing)
細胞內FRAP
一個相分離結構驗證標準：形成球狀結構，能夠融合，通過FRAP技術可證明其能夠發生熒光漂白恢複。
內容：對(dui)於(yu)活(huo)細(xi)胞(bao)內(nei)形(xing)成(cheng)的(de)相(xiang)分(fen)離(li)液(ye)滴(di)，使(shi)用(yong)激(ji)光(guang)共(gong)聚(ju)焦(jiao)顯(xian)微(wei)鏡(jing)觀(guan)察(cha)相(xiang)分(fen)離(li)液(ye)滴(di)經(jing)過(guo)光(guang)漂(piao)白(bai)之(zhi)後(hou)，液(ye)滴(di)淬(cui)滅(mie)區(qu)域(yu)熒(ying)光(guang)恢(hui)複(fu)情(qing)況(kuang)，由(you)此(ci)驗(yan)證(zheng)細(xi)胞(bao)內(nei)相(xiang)分(fen)離(li)液(ye)滴(di)的(de)流(liu)動(dong)性(xing)。
體外相分離融合及分裂
內容：蛋(dan)白(bai)在(zai)體(ti)外(wai)體(ti)係(xi)形(xing)成(cheng)相(xiang)分(fen)離(li)後(hou)，使(shi)用(yong)激(ji)光(guang)共(gong)聚(ju)焦(jiao)顯(xian)微(wei)鏡(jing)長(chang)時(shi)間(jian)拍(pai)攝(she)模(mo)塊(kuai)，觀(guan)察(cha)相(xiang)分(fen)離(li)液(ye)滴(di)的(de)融(rong)合(he)及(ji)解(jie)聚(ju)現(xian)象(xiang)，由(you)此(ci)驗(yan)證(zheng)體(ti)外(wai)相(xiang)分(fen)離(li)液(ye)滴(di)的(de)流(liu)動(dong)性(xing)
細胞內相分離融合及分裂
活細胞成像實驗，目的是觀察液滴融合或分離現象。
內容：對(dui)於(yu)活(huo)細(xi)胞(bao)內(nei)形(xing)成(cheng)的(de)相(xiang)分(fen)離(li)液(ye)滴(di)，使(shi)用(yong)激(ji)光(guang)共(gong)聚(ju)焦(jiao)顯(xian)微(wei)鏡(jing)長(chang)時(shi)間(jian)拍(pai)攝(she)模(mo)塊(kuai)，觀(guan)察(cha)相(xiang)分(fen)離(li)液(ye)滴(di)的(de)融(rong)合(he)及(ji)解(jie)聚(ju)現(xian)象(xiang)，由(you)此(ci)驗(yan)證(zheng)細(xi)胞(bao)內(nei)相(xiang)分(fen)離(li)液(ye)滴(di)的(de)流(liu)動(dong)性(xing)
三、蛋白相分離功能驗證
蛋白關鍵相分離位點預測
內容：利用機器學習建立的PSPHunter算法，基於蛋白氨基酸序列，識別蛋白的關鍵相分離驅動氨基酸區段
蛋白成相突變體以及突變回補體構建及成像驗證
為了驗證相分離對於蛋白功能的直接影響，我們通常需要在破壞蛋白成相能力以及回補其成相能力之後，進行功能性的驗證。
內容：在zai獲huo得de蛋dan白bai關guan鍵jian成cheng相xiang位wei點dian信xin息xi之zhi後hou，在zai避bi開kai蛋dan白bai重zhong要yao的de功gong能neng性xing結jie構gou域yu的de前qian提ti下xia，對dui於yu蛋dan白bai關guan鍵jian成cheng相xiang位wei點dian設she計ji突tu變bian，破po壞huai其qi相xiang分fen離li形xing成cheng能neng力li，並bing且qie通tong過guo融rong合he表biao達da已yi知zhi具ju有you相xiang分fen離li形xing成cheng能neng力li的de蛋dan白bai無wu序xu區qu短duan肽tai（例如FUS IDR、hnRNPac1 IDR、polyG等）進行成相能力回補。而後，通過構建相關真核及原核表達載體，並且在細胞內以及體外對於成相突變體的成相能力進行驗證。
四、蛋白與蛋白相互作用促進相分離功能驗證
體外X蛋白促進Y蛋白相分離
範例：RYBP體外促進CTCF相分離
體外X蛋白促進Y蛋白相分離沉澱實驗
範例：RYBP體外促進CTCF相分離沉澱實驗
五、TurboID鑒定相分離互作蛋白
傳統方法（如免疫沉澱）在鑒定動態、瞬時、弱相互作用蛋白質方麵存在局限性，包括無法呈現真實狀態、會破壞瞬時相互作用和無膜細胞器等。
TurboID 鄰近標記技術可在室溫下直接在活細胞中加入無毒的生物素（biotin），對目標蛋白及其鄰近蛋白進行快速標記（≥ 10 min），對細胞幹擾小，標記尺度更短（~10 nm）等特點，在同類鄰近標記技術（如 APEX、BioID 等）中表現最優。
通過 TurboID 標記後的蛋白複合物，可分解肽段進行 LC-MS/MS，也可富集 RNA 進行轉錄組測序（例圖15）。蛋白組分析和轉錄組分析結果示例如例圖16和例圖17所示。
TurboID 技術服務主要內容包括：
-
生物素標記效率驗證（Western Blot）
-
液滴共定位驗證（免疫熒光成像）
-
液滴互作蛋白圖譜構建（定量蛋白質組學）
-
液滴互作轉錄組測序
服務項目列表
廣州表觀生物科技有限公司
TEL:
參考文獻：
1. C. P. Brangwynne et al., Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation. Science 324, 1729-1732 (2009).
2. S. F. Banani, H. O. Lee, A. A. Hyman, M. K. Rosen, Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev Mol Cell Biol 18, 285-298 (20 17).
3. M. Kato et al., Cell-free formation of RNA granules: low complexity sequence domains form dynamic fibers within hydrogels. Cell 149, 753-767 (2012).
4. Berry, J et al., Physical principles of intracellular organization via active and passive phase transitions. Reports on Progress in Physics, 81(4), 046601(2018).
5. P. Li et al., Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. Nature 483, 336-340 (2012).
6. Wei C, Jia L, Huang X, et al. CTCF organizes inter-A compartment interactions through RYBP-dependent phase separation. Cell Res. 2022;32(8):744-760.
7. Zhao C, Cai S, Shi R, et al. HERD-1 mediates multiphase condensate immiscibility to regulate small RNA-driven transgenerational epigenetic inheritance. Nat Cell Biol. 2024;26(11):1958-1970.
8. Soto JS, Jami-Alahmadi Y, Chacon J, et al. Astrocyte-neuron subproteomes and obsessive-compulsive disorder mechanisms. Nature. 2023;616(7958):764-773.
9. Ramelow CC, Dammer EB, Xiao H, et al. Simultaneous profiling of native-state proteomes and transcriptomes of neural cell types using proximity labeling. Preprint. bioRxiv. 2025;2025.01.29.635500. Published 2025 Feb 1.