PA-Ψ-seq
項目簡介
假尿嘧啶（Pseudouridine，簡稱 Ψ）是 RNA 上常見的修飾類型，在 rRNA、tRNA 等 ncRNA 上的生物學功能已得到
廣泛研究與報道，但由於缺乏在 mRNA 上檢測 Ψ 修飾的技術，我們對 mRNA 的 Ψ 修飾功能尚不清楚。
表觀生物 PA-Ψ-seq[1]（photo-crosslinking-assisted Ψ sequencing，光交聯輔助 Ψ 修飾測序），基於抗體對 Ψ修飾進行精確定位，達到單核苷酸分辨率。
圖 1. PA-Ψ-seq 技術流程
技術原理
將 RNA 片段化，利用假尿嘧啶抗體進行免疫沉澱實驗。洗脫 RNA 片段，反轉錄成 cDNA，進行高通量測序。
應用與優勢
技術應用
1. 繪製全轉錄組的 Ψ 修飾圖譜
2. 研究 Ψ 修飾對各種生理過程的調控機製
3. 研究腫瘤等疾病的 Ψ 修飾異常表達
技術優勢
1. 光輔助技術將殘基交聯至同源抗體，特異性高
2. 分辨率高，達到單堿基水平
2. 分析內容豐富，多年 RNA 修飾技術經驗
送樣要求
樣本物種： 僅限人、大小鼠，其他物種需評估
≥ 300 μg/ 樣本，RIN 值≥ 6
總RNA
≥ 300 μg/ 樣本，RIN 值≥ 6
細胞
≥ 150 mg/ 樣本
組織
分析內容
基本分析
1. 測序原始 reads 去接頭 , 質量控製 (OC)
2. 參考基因組比對 (Mapping)
3. 富集區域鑒定 (PeakCalling)
4. 富集區域注釋 (PeakAnno)
5. mRNA 修飾分析
6. 富集區域 metagene 圖、pie 圖、venny 圖
7. Motif 分析
8. Peak 基因 GO 和 KEGG 分析
9. 差異 Peak 分析 ( 即差異 RNA 修飾 mRNA)
10. 差異 Peak 基因 GO 和 KEGG 分析
高級分析
1. 差異 RNA 修飾熱圖 (Heatmap)
2. 關聯分析 ( 與 RNA-seq 關聯分析或多組學關聯分析 )
3. 關聯分析熱圖 (Heatmap)
4. IGV 峰圖 ( 附 5 個基因 )
圖 2. 注釋類型餅圖
表觀生物實測數據
圖 3. IGV 基因峰圖
圖 4. 差異 Peaks 火山圖
圖 5. GO 差異 KEGG 分析氣泡圖
樣本設置：
研究主要使用結直腸癌細胞係HCT116、DLD-1、HT-29和對照細胞HeLa，通過siRNA敲低PUS7或反義寡核苷酸耗竭7SK進行實驗處理，每組設置2-3個生物學重複。同時分析了TCGA和GTEx數據庫中的結直腸癌臨床樣本數據。
使用的測序方法：
采用假尿嘧啶測序（BID-seq）在單堿基分辨率檢測核RNA的假尿苷修飾（鑒定363個Ψ位點）；PAR-CLIP-seq捕獲PUS7直接結合的RNA靶標（185個靶標）；KAS-seq監測全基因組Pol II轉錄動態；mRNA-seq分析轉錄組變化（1000+差異基因）；LC-MS/MS定量Ψ修飾水平。
關鍵結果：
研究發現PUS7催化7SK snRNA第250位尿苷的假尿苷化修飾（Ψ水平從72%降至48%），該修飾穩定7SK-P-TEFb複合物。PUS7缺失導致P-TEFb從7SK釋放，Pol II Ser2磷酸化增加40%，促進轉錄延伸。轉錄組分析顯示轉錄因子KLF6和凋亡基因DDIT3表達上調，介導細胞凋亡。功能實驗證實PUS7敲低顯著增強結直腸癌細胞對5-FU化療的敏感性。利用dCas13b-PUS7係統特異性增加7SK Ψ250修飾可逆轉上述表型，確證了因果關係。研究揭示PUS7-7SK軸是調控轉錄延伸的關鍵機製，為結直腸癌治療提供了新靶點。
應用案例
Nat Commun： PU S7通過調控7SK假尿苷化調節RNA聚合酶II轉錄延伸並影響結直腸癌化療敏感性 [2]
圖 6. Ψ 測序 利用反轉錄過程中Ψ位點產生的缺失信號， 實現單堿基分辨率的全轉錄組Ψ位點檢測和定量
圖 7. I）在HCT116細胞核RNA上共鑒定出363個Ψ位點；J）PUS7敲低後，42個位點的Ψ水平發生顯著變化，其中25個位點Ψ水平下降
參考文獻
[1] Martinez Campos C, Tsai K, Courtney DG, Bogerd HP, Holley CL, Cullen BR. Mapping of pseudouridine residues on cellular and viral transcripts using a novel antibody-based technique. RNA. 2021;27(11):1400-1411.
[2] Zhao Y, Sun HL, Li W, et al. Pseudouridylation of 7SK by PUS7 regulates Pol II transcription elongation. Nat Commun. 2025;16(1):9595. Published 2025 Oct