超級增強子研究方案
一、研究背景和研究意義
1.1 增強子
增強子（enhancer），是DNA上一小段可與蛋白質（反式作用因子；trans-acting factor）結(jie)合(he)的(de)區(qu)域(yu)，與(yu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)結(jie)合(he)之(zhi)後(hou)，基(ji)因(yin)的(de)轉(zhuan)錄(lu)作(zuo)用(yong)將(jiang)會(hui)加(jia)強(qiang)。增(zeng)強(qiang)子(zi)可(ke)能(neng)位(wei)於(yu)基(ji)因(yin)上(shang)遊(you)，也(ye)可(ke)能(neng)位(wei)於(yu)下(xia)遊(you)。且(qie)不(bu)一(yi)定(ding)接(jie)近(jin)所(suo)要(yao)作(zuo)用(yong)的(de)基(ji)因(yin)，甚(shen)至(zhi)不(bu)一(yi)定(ding)與(yu)基(ji)因(yin)位(wei)於(yu)同(tong)一(yi)染色體[1]。這是因為染色質的纏繞結構，使序列上相隔很遠的位置也有機會相互接觸。增強子具有以下特征)[1-4]：
(1) 增強子DNA 序列處於染色體疏鬆的區域，與核小體中組蛋白的修飾，轉錄因子的結合有關；(2) 增強子活性與其DNA 序列結合的組蛋白H3 的第4 位賴氨酸單甲基化(H3K4me1)和第27 位賴氨酸乙酰化(H3K27ac)修飾程度成正相關[6]；(3) 增強子發揮功能需要增強子區域和啟動子的區域的直接相互作用，形成三維環狀結構(3D-loop)。增強子和啟動子的相互作用由多種蛋白介導，如Mediator 複合體、Cohesin 等[5.6]。
在真核生物細胞裏，DNA的染色質複合體結構像原核生物的超螺旋一樣折疊。所以雖然增強子與基因相距很多核苷酸，但在幾何上兩者距離很近。使增強子與總轉錄因子及RNA多聚酶II的相互作用成為可能。增強子可以在被它調控基因的上遊或下遊。而且增強子不一定靠近轉錄起始位點才能調控基因轉錄，已發現有些距離達幾十萬堿基對。增強子通過與激活蛋白的結合對啟動子（不直接對啟動子本身）起作用。這些激活蛋白與中介複合物（輔激活物）相互作用，後者通過使用多聚酶II和總轉錄因子開始基因轉錄。曾經在內含子內nei發fa現xian增zeng強qiang子zi。有you時shi增zeng強qiang子zi的de方fang向xiang顛dian倒dao後hou並bing不bu影ying響xiang它ta的de功gong能neng。而er且qie增zeng強qiang子zi可ke被bei切qie除chu並bing插cha入ru到dao染ran色se體ti的de其qi他ta位wei置zhi，仍reng然ran影ying響xiang基ji因yin轉zhuan錄lu。這zhe就jiu是shi雖sui然ran內nei含han子zi並bing不bu轉zhuan錄lu但dan其qi多態性會起作用。
1.2 超級增強子
超級增強子（Super enhancer, SE）是一類具有超強轉錄激活特性的順式調控元件，2013年由美國美國白頭生物醫學研究所（WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch）學者Richard A. Young首次提出。與普通增強子（Typical enhancer, TE）相比，超級增強子區域跨度範圍通常可達 8-20 Kb，遠高於普通增強子的200-300 bp跨度範圍。更重要的是，超級增強子比普通增強子具有更高密度的轉錄激活相關組蛋白修飾（H3K27ac、H3Kme1等）、Mediator複合體和Bromodomain containing 4 蛋白(BRD4，與組蛋白乙酰化修飾位點結合)的結合；輔因子（Mediator等）及轉錄因子富集密度 [7]。以上特點決定了超級增強子具有強大的調控功能。
(1) 超級增強子具有高密度的H3K27ac 和H3K4me1 修飾，以及Mediator複合體和Bromodomain containing 4 蛋白(BRD4，與組蛋白乙酰化修飾位點結合)的結合；(2) 超級增強子結合的轉錄因子以及與轉錄活性相關的染色體的標記比普通增強子高很多；(3) 超級增強子調控的基因比普通增強子調控的基因表達水平高很多；(4) 組成超級增強子的單個增強子也可以像普通增強子一樣激活基因轉錄；(5) 超級增強子可以結合組織中特異的轉錄因子；(6) 與普通增強子相比，超級增強子活性對於轉錄因子的阻斷更敏感[8,9]。
近些年來研究發現，超級增強子在癌症發生、細胞分化、免疫應答等重要生物學過程中發揮著重要調控功能，其所調控的基因包含原癌及抑癌基因、細胞身份決定基因、炎症通路關鍵基因等 [10-13]。由於許多腫瘤細胞關鍵致癌基因由超級增強子驅動，超級增強子有潛力成為理想的抗癌靶點，已成為世界科技前沿的研究熱點。
增強子研究逐漸升溫
1.3 超級增強子與腫瘤
Richard A. Young最早是在多發性骨髓瘤細胞中發現超級增強子的區域募集了高濃度的 Mediator複合體和BRD4[14]的，並證明超級增強子調控的基因（MYC、IRF4、PRDM1、XBP1）對於多發性骨髓瘤的發生和發展起到關鍵的促進作用[14]。
目前，超級增強子已被報道與多種疾病發生發展有關，其中包括了不同類型的腫瘤，比如彌漫性大B細胞淋巴瘤、T細胞急性淋巴細胞白血病、默克爾細胞癌、急性髓性白血病、小細胞肺癌、卵巢癌、上皮癌、 鱗狀細胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、食管鱗狀細胞癌和結腸癌等[15]。
大da部bu分fen研yan究jiu表biao明ming，超chao級ji增zeng強qiang子zi的de激ji活huo對dui腫zhong瘤liu細xi胞bao的de惡e性xing轉zhuan化hua具ju有you促cu進jin作zuo用yong。超chao級ji增zeng強qiang子zi在zai腫zhong瘤liu細xi胞bao中zhong調tiao控kong關guan鍵jian的de癌ai基ji因yin，從cong而er對dui腫zhong瘤liu生sheng成cheng和he腫zhong瘤liu特te性xing維wei持chi起qi到dao關guan鍵jian作zuo用yong。超chao級ji增zeng強qiang子zi能neng夠gou富fu集ji腫zhong瘤liu細xi胞bao依yi賴lai的de信xin號hao通tong路lu的de轉zhuan錄lu因yin子zi，比bi如ru在zai Wnt 信號通路異常引起的結腸癌細胞中，相關的超級增強子區域富集了很多由 Wnt 信號通路終端的轉錄因子 4 (tra-nscription factor 4, TCF4)，通過激活或者抑製 Wnt 信號通路，可以控製超級增強子調控的基因轉錄[16,17]。在雌激素受體（estrogen receptor, ER）陽性的乳腺癌細胞中，相關的超級增強子區域聚集了大量的ERα; 而在三陰性乳腺癌細胞中缺少類固醇激素的表達, 與其相關的超級增強子區域富集了完全不同的轉錄因子[18]。
在另一方麵，腫瘤細胞的信號通路可以反過來對超級增強子的活性進行調控。Licht 等人發現 Ras-Erk 活性與超級增強子的活性密切相關：抑製Ras蛋白的活性會導致超級增強子相關的特征（如H3K27ac）消失、活性下降、降低相關基因轉錄；激活Ras可以增強調控癌基因的超級增強子活性[19]。此外，促癌信號通路可以通過操縱轉錄機器調節超級增強子的活性，比如通過調節RNA聚合酶II的轉錄暫停狀態[20]：肝癌中YAP（Yes associated protein）蛋白結合到超級增強子上，募集Mediator和CDK9（細胞周期素依賴性激酶9）使暫停的Pol II進入延伸狀態，促進癌基因轉錄。通過激活超級增強子促進癌基因的轉錄。
綜上，超級增強子可以作為連接癌基因信號通路和維持腫瘤細胞特性的基因轉錄表達的渠道；反過來，信號通路也能夠調控超級增強子與轉錄因子在超級增強子區動態結合：在 NOTCH1 異常導致的 T 細胞白血病(T-ALL) 細胞中，NOTCH1在基因組上具有普遍的結合，但是隻有不到10%的基因對於NOTCH1信號通路的改變有應答，而這些應答基因的NOTCH1均結合在對應的超級增強子上，如果這些位點丟失，NOTCH1的結合就會導致超級增強子的特征消失[21]。
除了腫瘤以外，與超級增強子異常相關的疾病還包括有：阿爾茲海默症、類風濕關節炎、克羅恩病[22]。這些與免疫相關的疾病主要是由於T細胞產生了突變，而通過進一步的分析發現，這些突變位點大量分布於超級增強子區域內[22]。
1.4 （超級）增強子與miRNA
研究表明，增強子與microRNA（miRNA）間同樣存在複雜的調控關係。Xiao等[23]發現增強子對miR-24-1鄰近基因的轉錄是必需的miR-24-1通過激活增強子RNA（eRNA）表達，改變組蛋白修飾，增加增強子位點p300和RNA Pol II的富集，從而激活轉錄；Suzuki等證明增強子可以通過募集Drosha和DGCR8，調控成熟的miRNA在細胞中的水平，進而影響基因的表達[24]。
1.5 超級增強子與相分離
物質的相分離是在自然界中普遍存在的物理現象，通常指的是在均勻的混合液/氣態物質中自發形成的不同相。生物大分子的相分離(phase separation)凝聚是驅動無膜細胞器形成的主要機製[25]。在體內相分離通常是一個動態的過程，大部分情況下指的是“液–液相分離”（liquid-liquid phase separation）。
2009年，Hyman等人發現線蟲胚胎中的RNA和包含蛋白質的結合體P顆粒（P granules）實際上是由蛋白質通過相分離形成的凝聚小球[26]。2011年，該實驗室對核仁進行了類似的研究，證實了相分離是核仁發生的基礎[27]。2017年，Richard A. Young實驗室提出一個解釋超級增強子通過相分離參與基因調控的模型[28]。2018年，該實驗室通過實驗證明了上述模型[29]：胚胎幹細胞中的轉錄共激活因子MED1和BRD4通過相分離形式在超級增強子處成簇分布，並且起到調控基因表達的作用。
如(ru)今(jin)越(yue)來(lai)越(yue)多(duo)的(de)研(yan)究(jiu)者(zhe)開(kai)展(zhan)了(le)相(xiang)分(fen)離(li)研(yan)究(jiu)。現(xian)有(you)的(de)研(yan)究(jiu)成(cheng)果(guo)表(biao)明(ming)，相(xiang)分(fen)離(li)現(xian)象(xiang)對(dui)細(xi)胞(bao)核(he)的(de)染(ran)色(se)質(zhi)空(kong)間(jian)結(jie)構(gou)的(de)組(zu)織(zhi)調(tiao)控(kong)非(fei)常(chang)重(zhong)要(yao)，探(tan)究(jiu)相(xiang)分(fen)離(li)現(xian)象(xiang)與(yu)染(ran)色(se)質(zhi)的(de)結(jie)構(gou)和(he)功(gong)能(neng)的(de)關(guan)係(xi)具(ju)有(you)重(zhong)要(yao)的(de)意(yi)義(yi)。
1.6 超級增強子的臨床應用
超級增強子的先驅者Richard A. Young與JQ1/iBET研發者Bradner J.E.這zhe兩liang位wei科ke學xue家jia曾zeng預yu言yan超chao級ji增zeng強qiang子zi具ju有you廣guang闊kuo的de研yan發fa前qian景jing和he價jia值zhi，必bi將jiang成cheng為wei下xia一yi個ge藥yao物wu研yan發fa的de黃huang金jin靶ba點dian，有you望wang開kai發fa一yi種zhong精jing確que影ying響xiang基ji因yin調tiao控kong元yuan件jian的de藥yao物wu。這zhe兩liang位wei科ke學xue家jia也ye因yin此ci聯lian手shou成cheng立liSyros公司，研發針對超級增強子的抗癌藥。經過了6年的發展，如今以超級增強子為靶點的腫瘤治療用小分子抑製劑已進入臨床研究階段。
表 1 在腫瘤治療中以超級增強子為靶點的小分子抑製劑研究現狀[30]
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小分子抑製劑 |
靶點 |
疾病 |
臨床研究 |
文獻 |
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JQ1 |
BRD4 |
多發性骨髓瘤 |
— |
31 |
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Merkel 細胞癌 |
— |
32 |
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iBET151 |
BRD4 |
白血病 |
— |
33 |
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iBET762 |
BRD2, BRD3 BRD4 |
NUT 中線癌 |
I期臨床(NCT01587703) |
33 |
|
BETd-246 |
BRD2, BRD3 BRD4 |
三陰性乳腺癌 |
— |
34 |
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OTX015 |
BRD2, BRD3 BRD4 |
成神經細胞瘤 |
臨床前研究 |
35 |
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彌漫性大 B 細胞淋巴瘤 |
I期臨床(NCT01713582) |
35 |
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急性淋巴細胞白血病 |
I期臨床(NCT01713582) |
36,37 |
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NUT 中線癌 |
I期臨床(NCT02259114) |
33 |
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多行性成膠質細胞瘤 |
I期臨床(NCT02296476) |
33 |
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|
CPI0610 |
BRD4 |
多發性骨髓瘤 |
I期臨床(NCT02157636) |
33 |
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淋巴瘤 |
I期臨床(NCT01949883) |
33 |
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THZ1 |
CDK7 |
食管鱗狀細胞瘤 |
— |
38 |
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成神經細胞瘤 |
— |
38 |
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成人T細胞白血病 |
— |
39 |
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小細胞肺癌 |
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40 |
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SY-1365 |
CDK7 |
成人晚期實體瘤 |
I期臨床(NCT01587703) |
Syros公司 |
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乳腺癌（與氟維司群聯合） |
臨床前研究 |
Syros公司 |
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SY-1425 |
RARα |
急性髓樣細胞樣白血病 |
I期臨床(NCT01587703) |
Syros公司 |
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骨髓增生異常綜合征 |
I期臨床(NCT01587703) |
Syros公司 |
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THZ531 |
CDK12/13 |
急性T細胞淋巴瘤 |
— |
41 |
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Lee011 |
CDK4/6 |
尤因肉瘤 |
— |
42 |
2.2 研究內容及關鍵技術
1. 研究內容：采用H3K37ac ChIP-seq鑒定（超級）增強子
關鍵技術：
超級增強子的鑒定，依據的是增強子轉錄活性標記分子結合水平強度的差異，這些分子包括輔因子（如Mediator和cohesin）、組蛋白修飾標記（如H3K27ac和H3K4me1）、染色質修飾分子（如p300）等。在鑒定過程中，首先通過ChIP-Seq分(fen)析(xi)這(zhe)些(xie)增(zeng)強(qiang)子(zi)轉(zhuan)錄(lu)活(huo)性(xing)標(biao)記(ji)分(fen)子(zi)在(zai)基(ji)因(yin)組(zu)上(shang)的(de)富(fu)集(ji)情(qing)況(kuang)，確(que)定(ding)活(huo)性(xing)增(zeng)強(qiang)子(zi)位(wei)點(dian)。之(zhi)後(hou)再(zai)對(dui)所(suo)有(you)活(huo)性(xing)增(zeng)強(qiang)子(zi)進(jin)行(xing)分(fen)析(xi)，鑒(jian)定(ding)得(de)到(dao)超(chao)級(ji)增(zeng)強(qiang)子(zi)。通(tong)過(guo)與(yu)轉(zhuan)錄(lu)組(zu)測(ce)序(xu)數(shu)據(ju)進(jin)行(xing)關(guan)聯(lian)分(fen)析(xi)，可(ke)發(fa)現(xian)超(chao)級(ji)增(zeng)強(qiang)子(zi)所(suo)調(tiao)控(kong)的(de)靶(ba)基(ji)因(yin)。
技術應用
1. 發現致病驅動基因
2. 分析疾病關聯變異位點易感性
3. 開發基於超級增強子複雜性疾病的精準診斷和藥物開發
樣本要求
樣本類型:
1. 甲醛交聯的細胞樣本，細胞數量≥1×107
2. 組織樣本需評估
僅限人、大小鼠,其他物種需評估
樣品分組
1. 常規要求至少 2 組樣品,包括對照組和實驗組
2. 樣本數建議：3 VS 3
主要分析內容
1. TE 與 SE 鑒定分析
2. TE 與 SE ChIP-seq 峰圖對比
3. TE 與 SE 信號富集圖繪製
4. TE 與 SE 差異(長度與數目)分析
5. SE 調控靶基因 GO、KEGG 分析
6. SE 結合轉錄因子預測(motif)
2. 研究內容：采用CAPTURE技術研究增強子相互作用的DNA、RNA和蛋白質
關鍵技術：
CAPUTURE（CRISPR affinity purification in situ of regulatory elements），即CRISPR親和純化原位調控元件，利用CRISPR的特異靶向能力，以及生物素-鏈黴親和素的互作優勢，建立高分辨率、位點特異性極高的順式調控元件（如增強子）的蛋白質、RNA和遠程的DNA互作網絡圖譜。
技術原理：
CAPTURE係統三個元件：FB-dCas9(N端含FLAG和生物素接受位點的dCas9)、生物素連接酶BirA，靶標特異性的sgRNA
在體內用生物素連接酶BirA給dCas9標記上生物素，加上序列特異的sgRNA，高親和鏈黴素就能分離純化基因組位點相關的大分子。提取到的蛋白、RNA和DNA複合物，分別用質譜和高通量測序研究，獲知順式調控元件的蛋白、RNA和遠程的DNA相互作用。
CAPTURE-seq/MS技術有以下優點：
(1) 靈敏度高。生物素和鏈酶親和素的親和力 (affinity) 達到Kd = 10-14mol/L，是抗體介導的相互作用的1000倍以上，這樣就可以更高效和更穩定地捕獲蛋白—DNA複合物。
(2) 特異性高。這個方法沒有使用抗體，能顯著減少非特異性結合，此外，生物素—鏈黴親和素出眾的穩定性，利於進行嚴格的純化過程，減少蛋白汙染。
(3) 適用於多種方法。研究者可以改變sgRNA序列或組合來操縱dCas9 /sgRNA係統，那就可以作為研究染色質相互作用的高通量測序分析媒介。
示意圖：
樣本要求
樣本類型：活細胞樣本，1x108個細胞每樣本；
樣本物種：僅限人、大小鼠，其他物種需評估。
分析內容：
CAPTURE-seq
1. 去接頭汙染，去低質量reads和測序質量評估
2. CAPTURE-seq序列與參考基因組序列的比對
3. CAPTURE-seq唯一reads在全基因組的分布
4. Peaks鑒定及基因元件分析
6. Peaks相關基因篩選與GO功能聚類分析、Pathway 分析
7. Peaks可視化
8. Peaks Motif 分析
1. CAPTURE捕獲產物蛋白質質譜鑒定結果
1.1 唯一譜圖分布
1.2 唯一肽段分布
1.3 蛋白質量分布
1.4 蛋白覆蓋度分布
1.5 肽段長度分布
2. CAPTURE捕獲產物詳細鑒定列表
2.1 譜圖鑒定列表
2.2 肽段鑒定列表
2.3 蛋白鑒定列表
3. CAPTURE捕獲產物功能分析
3.1 GO注釋
3.2 COG注釋
3.3 Pathway注釋
3. 研究內容：利用ATAC-seq研究染色質開放性，初步判斷是否涉及表觀遺傳調控機製
關鍵技術：
染色質開放性是指真核生物染色質DNA和轉錄因子等蛋白能否結合的開放程度，這一特性反映了染色質轉錄活躍程度，結合其他DNA修飾（如甲基化）信xin息xi，特te定ding條tiao件jian下xia的de染ran色se質zhi開kai放fang性xing變bian化hua可ke以yi提ti供gong大da量liang的de基ji因yin表biao達da調tiao控kong信xin息xi，為wei各ge種zhong蛋dan白bai結jie合he新xin位wei點dian的de發fa現xian指zhi明ming方fang向xiang。還hai可ke分fen析xi初chu生sheng組zu織zhi和he細xi胞bao（如胰島β細胞）、臨床患者樣本，基於染色質開放性特征對患者和樣品進行分類。
ATAC-seq（Assay of Transposase Accessible Chromatin with High-throughput sequencing），即染色質開放性檢測，利用轉座酶研究染色質可接近性的高通量測序技術 [9]。2013年，美國斯坦福大學William Greenleaf教授報道了其研發的ATAC-seq，利用DNA轉座酶取代傳統研究開放染色質區域使用的DNA酶，準確率與傳統方法一致，且重複性更高，隻需少量細胞/組織，就能完成高質量的測序，是目前研究染色質開放性的最優策略。
技術原理：
圖1-12. ATAC-seq技術原理
A, ATAC-seq 文庫構建示意圖。轉座子隻能插入開放的染色質 DNA,所以利用 Tn5 轉座酶,將攜帶測序標簽的轉座複合物加入到細 胞核中,後續利用標簽進行 PCR 擴增,即可識別開放染色質; B, 轉座後成為 DNA 片段。在 72° C 延長,與 adapter 連接,再擴增,隨 後 PCR 擴增出來的序列就包含了 adapter、共有序列末端、測序標簽。
技術應用:
對於未知表觀遺傳是否在細胞係統的應答發揮作用的情況，或者不清楚哪種組蛋白修飾、轉錄因子是最重要的, 或者細胞數量很少的情況前提下，ATAC-seq是比ChIP-seq更適合的一種研究技術。
1. 初步判斷所研究的課題是否涉及表觀遺傳調控機製
2. 結合基序分析,識別參與基因調控的轉錄因子
3. 識別轉錄因子調控的靶基因和功能元件
4. 與超級增強子鑒定聯合分析,明確活性超級增強子的範圍
5. 通過開放的染色質圖譜，可以更好地了解藥物或疾病的基因調控和細胞應答機製；識別驅動細胞命運、疾病或應答相關的轉錄因子
技術優勢
1. 靈敏性高,低細胞起始量，每個樣本 50,000 個細胞即可
2. 實驗步驟簡化，實驗重複性好，成功率高
3. 能同時揭示開放染色質的基因組位置、DNA結合蛋白和轉錄結合位點的相互作用
樣本要求
樣本類型:
1. 活細胞樣本，50,000 個細胞每樣本
2. 組織樣本，質量≥ 100mg
僅限人、大小鼠，其他物種需評估
樣品分組
1. 常規要求至少 2 組樣品，包括對照組和實驗組(臨床樣本為正常人組和患者組)
2. 樣本數建議：3 VS 3
分析內容
1. 基因組比對分析
2. 基因組富集分析
2.1 富集區域基本信息
2.2 富集區域分布特征
2.3 Peak 相關基因 GO 分析
2.4 Peak 相關基因 KEGG 分析
3. 富集區域 motif 分析
4. 研究內容：采用HiChIP技術研究與增強子相互作用的蛋白質
關鍵技術：
HiChIP（in situ Hi-C followed by chromatin immunoprecipitation）是一種用於解析染色質構象的全新技術，該方法由Howard Chang 實驗室建立，2016 年11 月份發表於Nature Methods[7]。HiChIP 結合了Hi-C 與ChIA-PET 兩大技術的特點，並進一步與轉座酶介導文庫構建技術結合起來，用更小的數據量獲取更高分辨率的染色質三維結構信息。利用HiChIP技術，可在三維構象水平研究DNA 和蛋白接觸點，挖掘一維測序數據（ChIP-seq 和ATAC-seq）無法揭示的相互作用。
表1-1. Hi-C 和ChIA-PET 及HiChIP 技術的比較
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優 點 |
不 足 |
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Hi-C |
解析所有染色質構象 |
深度測序需要完全解析染色質特征，染色質構象數據量龐大；特異性不好；信號背景比低 |
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ChIA-PET |
產生感興趣蛋白因子有關的長範圍聯結 |
細胞需要量大；產生小片段的reads；感興趣基因的reads 很少；低效，有假陽性 |
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HiChIP |
細胞需要量小；目標基因reads 多；信號背景比高；特異性好；快速，高效，方便 |
僅生成感興趣蛋白因子結合的染色質構象 |
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技術原理
圖1-9. HiChIP-seq 技術流程
HiChIP 在裂解細胞前就在細胞核中交聯，從而降低假陽性，最大化提高DNA contact 的捕獲效率。然後收集細胞核，在原位產生Hi-C 交聯，利用生物素標記DNA 末端，裂解細胞核，超聲打斷DNA，後續用特異性的抗體進行ChIP 實驗。得到DNA 蛋白複合物後，進行DNA 洗脫和反向交聯。隨後，利用生物素捕獲Hi-C 交聯和文庫製備， 上機測序。
• 技術應用
1. 針對特定蛋白的染色質互作構象分析
2. 轉錄因子作用機製研究
3. 表觀修飾對基因調控的機製研究
• 技術優勢
1. 構象信息讀取的產量提高了10 倍以上
2. 相對於ChIA-PET，樣本要求降低了100 倍以上
3. 所需細胞數量低於Hi-C 且比Hi-C 具有更大的信噪比
4. 可獲取特定的染色質三維結構信息
• 樣本要求
樣本類型：活細胞樣本，交聯細胞數量≥ 1.5×107
樣本物種：僅限人、大小鼠，其他物種需評估
其他注意事項：
1. 前期準備需要固定細胞，提供細胞沉澱，通過幹冰運輸。細胞固定方案請谘詢技術支持
2. 不具備前期準備條件的，需提供活細胞及配套培養基， 常溫運輸
5. 研究內容：采用GRO-seq技術研究新生RNA、eRNA
關鍵技術：
GRO-seq（Global nuclear Run-On sequencing），是一種專門測量新生RNA的技術。新生RNA的變化直接反映了轉錄調控的多種機理。利用GRO-seq技術，可以知道RNA聚合酶所在位點，從而檢測基因組上正在進行的轉錄；還能高效檢測到目標樣本中的eRNA分子。
增強子相關RNA（eRNA）是由基因功能元件增強子轉錄產生的一類長鏈非編碼RNA，在基因轉錄調控和疾病的發生發展中發揮重要的作用，是近年來非編碼RNA領域的新熱點。多數eRNA具有轉錄雙向性和非多聚腺苷酸反應性，並且eRNA 的產生通常和近端基因誘導相關聯。eRNA主要通過和其目標啟動子相連並相互作用來實現對下遊基因的調控，利用分子關聯分析和DNA 圈連均證明了eRNA這一作用機製。目前，eRNA已被證明和前列腺癌、乳腺癌和甲狀腺癌等多種癌症相關，將有望作為疾病治療的創新靶點。
由於eRNA在結構上穩定性低，存在周期短，因此常規的轉錄組測序方法難以靈敏的捕捉到。利用表觀生物創新的GRO-seq測序技術可以檢測eRNA分子，為疾病的分子機製研究開拓全新的研究領域。全基因組轉錄的“快照”（snapshot），直接檢測啟動子近端POL暫停現象
技術原理：
先提取細胞核，添加Run on buffer，然後加入核糖核苷酸類似物BrUTP，使新生RNA帶上BrU標記。利用針對BrUTP的抗體，免疫提取出帶標記的新生RNA，構建文庫，進行高通量測序。
技術應用
1. 獲得全基因轉錄的“快照”（snapshot），定位RNA聚合酶位點和轉錄位點
2. 可直接觀察啟動子近端RNAP II暫停等現象，進一步探索增強子等遠程調控元件的轉錄調控機製
2. 鑒定eRNA
樣本要求
樣本類型：細胞樣本，細胞數量≥1×107
僅限人、大小鼠,其他物種需評估
分析內容
1. 去接頭汙染，去低質量reads和測序質量評估
2. 測序序列與參考基因組序列的比對
3. Reads在全轉錄組的分布；
4. Reads在轉錄起始位點（TSS）附近的meta分析；
5. 轉錄暫停基因分析
6. eRNA分析
7. 差異基因篩選與GO功能聚類分析、Pathway 分析
6. 研究內容：利用dCas9-p300提高目的基因H3K27ac水平，激活目的基因
關鍵技術：
dCas9-p300是基於CRISPR/Cas 9基因調控係統的一種靶向乙酰化工具，把dCas9蛋白融合到人乙酰轉移酶p300的催化核心而成。dCas9-p300能催化它靶位點的H3K27乙酰化，有效激活啟動子、近端增強子和遠端增強子上的靶基因。它能夠實現靶向乙酰化，是表觀基因組調控編輯的有力工具。
技術原理：
dCas9，即dead cas9，工程化缺陷型核酸酶，是Cas9蛋白的突變體，Cas9蛋白的RuvC1和HNA兩個核酸酶活性區域同時發生突變。因此，dCas9蛋白的內切酶活性完全消失，隻保留由gRNA引導進入基因組的能力。dCas9可以與不同蛋白形成融合蛋白，再由特定的gRNA導向而結合於特定的基因組位點，繼而經由不同融合蛋白行使不同於Cas9的其他功能。
人類E1A相關蛋白p300是組蛋白乙酰化的關鍵成分，p300的催化核心與dCas9融合，組成了dCas9-p300。當gRNA靶向編碼區或啟動子區時，這個係統可成功誘導基因高表達。特別是，當靶向啟動子或增強子時，基因表達可增強50至10,000bei。tongguozhuanluzufenxipinggudedao，zhezhongbaxiangdeyixianzhuanyimeiduijiyindejihuozaijiyinzushangshigaoduteyide，gaixitongkeyijingquetiaokongmouduanransezhidebianhua。
技術應用
1. 增加靶向增強子和其下遊基因啟動子的H3K27ac水平
2. 研究調控元件和靶基因表達背後的機製。
7. 研究內容：利用dCas9-KRAB使目的基因三甲基化，抑製目的基因
關鍵技術：
dCas9融合KRAB（Krüppel-associated box）後，作為一種CRISPRi，可以高度特異地誘導H3K9三甲基化（H3K9me3），從表觀遺傳修飾層麵可逆地抑製靶基因的表達。對哺乳動物細胞係而言，dCas9-KRAB比單獨的dCas9的抑製能力更優異，且對細胞生長影響小，是一種無毒且高效的基因沉默方法。
技術原理
KRAB結構域能募集內源染色質修飾複合物，包括KAP1共抑製複合物和核小體重構及去乙酰化酶（NuRD）複合物。KAPI複合物裏含有一個組蛋白甲基化轉移酶SERDB1，因而能夠使組蛋白H3K9發生三甲基化、去乙酰化，是使用最廣泛的抑製子，有著強大的抑製能力，常用於高通量基因篩選。
dCas9-KRAB融合蛋白對靶位點的作用是短暫的，當轉錄修飾蛋白去除後，可以重新建立轉錄，也就是可逆的。可設計gDNA結合到靶基因轉錄起始位點（TSS），抑製轉錄起始，沉默靶基因的表達。
技術應用
1. 瞬時轉染到細胞，即可降低gDNA靶基因的表達。
2. 可靶向基因啟動子區或轉錄起始位點，顯著抑製基因。
3. 設計合適的gRNA，可降低miRNA等非編碼RNA的表達。
三、研究技術路徑圖
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