三代單細胞免疫組庫測序

BD單細胞V(D)J測序是在BD Rhapsody™係(xi)統(tong)中(zhong)利(li)用(yong)剛(gang)性(xing)磁(ci)珠(zhu)，在(zai)微(wei)孔(kong)中(zhong)進(jin)行(xing)單(dan)細(xi)胞(bao)捕(bu)獲(huo)過(guo)程(cheng)使(shi)配(pei)套(tao)的(de)成(cheng)像(xiang)係(xi)可(ke)以(yi)進(jin)行(xing)全(quan)程(cheng)質(zhi)控(kong)分(fen)析(xi)出(chu)細(xi)胞(bao)捕(bu)獲(huo)率(lv)統(tong)計(ji)，捕(bu)獲(huo)後(hou)的(de)磁(ci)珠(zhu)理(li)論(lun)上(shang)可(ke)保(bao)存(cun)三(san)個(ge)月(yue)。隨(sui)後(hou)進(jin)行(xing)標(biao)準(zhun)的(de)建(jian)庫(ku)。其(qi)技(ji)術(shu)原(yuan)理(li)的(de)關(guan)鍵(jian)是(shi)利(li)用(yong)自(zi)然(ran)沉(chen)降(jiang)的(de)方(fang)法(fa)，在(zai)特(te)製(zhi)的(de)U型槽中捕獲單個細胞，輔助偶聯Cell lab以及UMI序列的剛性磁珠標記不同樣品（Cell label標記單個細胞

，UMI標記每個細胞內不同的RNA序列）。 單細胞V(D)J測序可以將TCR/BCR雙(shuang)鏈(lian)完(wan)美(mei)匹(pi)配(pei)，而(er)且(qie)可(ke)以(yi)細(xi)化(hua)到(dao)單(dan)細(xi)胞(bao)水(shui)平(ping)，同(tong)時(shi)獲(huo)得(de)表(biao)達(da)譜(pu)信(xin)息(xi)
，但(dan)是(shi)一(yi)般(ban)單(dan)細(xi)胞(bao)測(ce)序(xu)和(he)二(er)代(dai)測(ce)序(xu)技(ji)術(shu)相(xiang)結(jie)合(he)
，由(you)於(yu)二(er)代(dai)測(ce)序(xu)長(chang)度(du)限(xian)製(zhi)導(dao)致(zhi)測(ce)序(xu)區(qu)域(yu)丟(diu)失(shi)V區上遊序列信息
，並不能夠得到CDR3的全長mRNA序列。

（A），V-J基因組合頻率Circos圖
，每個顏色塊代表一種基因，顏色塊越寬

，頻率越高。色塊間的連線代表一種V-J基因組合方式。 （B）
，克隆頻率分布，橫縱坐標分別為克隆數和克隆頻率。 （C），克隆頻率分布甜甜圈圖。第一層為1個reads、2個reads及≥3 reads支持的克隆類型比例；第二層為≥3 reads支持的克隆類型中，top 20%
、20%-40%、40%-60%
、60%-80%、80%-100%克隆的累積頻率分布；第三層為top5克隆類型的頻率分布及對應的氨基酸序列。 （D），Top20 V基因頻率組間分布柱狀圖。

研究目的：尋找免疫檢查點（PD-1
、CTLA-4）治療療效的biomarker 研究樣本：11例未轉移肺腺癌，共45 tumor regions (2 to 5 regions per tumor) 研究技術：WES、TCR sequencing 研究結果：病灶特有突變導致新抗原（neoantigen）的內部表達差異
，因此
，產生不同的免疫原性

，形成了TIL克隆內部差異（TCR ITH）。TCR ITH（intratumor heterogeneity）高與術後疾病複發和低生存率有關。 （A）年齡與MOI相關性
； （B）新抗原與MOI負相關； （C）複發的病人具有更高的TCR ITH（lower MOI）
； （D）MOI越高（TCR克隆多樣性越低）
，病人的無病生存期（disease-free survival）越長。MOI：克隆重疊指數
，範圍0-1，0代表克隆完全不同
，1代表克隆完全相同。