單細胞轉錄組測序研究方案
1.立項依據
1.1研究背景
伴隨著醫學技術的發展，疾病已經初步進入了個體化治療階段。從2009年研究人員對小鼠單個四細胞胚胎期轉錄組進行單細胞水平分析[1]；到2011年一種腫瘤研究新方法單細胞測序技術（single cell se⁃quencing，SCS）的出現[2]；再到2013 年，研究人員首次對病人外周血循環腫瘤細胞（circulation tumor cell，CTC）進行單細胞測序［3］，SCS測序逐漸成為一種成熟的醫學技術手段，為科學家從不同的視角揭示細胞不同階段的功能和特性提供思路。SCS主zhu要yao包bao括kuo轉zhuan錄lu組zu測ce序xu，基ji因yin組zu測ce序xu，表biao觀guan遺yi傳chuan測ce序xu和he多duo組zu學xue測ce序xu。應ying用yong最zui廣guang泛fan的de單dan細xi胞bao轉zhuan錄lu組zu測ce序xu，它ta可ke獲huo得de特te定ding組zu織zhi中zhong所suo有you狀zhuang態tai下xia的de轉zhuan錄lu本ben。目mu前qian為wei止zhi測ce序xu結jie果guo絕jue大da多duo數shu是shi對dui細xi胞bao團tuan或huo組zu織zhi塊kuai進jin行xing的de混hun合he分fen析xi，它ta反fan映ying的de是shi樣yang本ben中zhong優you勢shi細xi胞bao的de信xin息xi。但dan是shi細xi胞bao往wang往wang具ju有you異yi質zhi性xing，會hui導dao致zhi低di豐feng度du的de信xin息xi丟diu失shi掉diao[4]。因此SCS對丟失低豐度信息的多細胞測序有很好的補充，目前SCS已經應用到腫瘤，遺傳學和免疫學等研究領域中[5]。
2.研究目標
目標一、分析正常人和病人組織中細胞亞群的異同；
目標二、分析細胞亞群中marker基因；
目標三、分析細胞分化的軌跡；
3.研究內容
內容一、獲得正常人及病人樣本組織中的單細胞；
內容二、對質控後的單細胞測序數據進行分選；
內容三、分析細胞亞群中的基因轉錄信息；
內容四、對單細胞測序數據進行GO/KEGG分析；
內容五、細胞軌跡的分化重建分析。
4.創新點和擬解決的關鍵科學問題
4.1創新點
muqianshengmingkexueyanjiuzhongyouhenduowentinanyijiejue，biruwufafenxizhongliuyizhixingdeyangbenzhongdanxibaodexinxi，wufashenrutanjiupeitaifayuguochengzhongdefayujizhi，wufafenximianyixibaozaibutongzuzhizhongdezhuanluzhuangtai。erdanxibaocexufenxikeyihenhaodejiejuecileiwenti，keyigaofenbielvdehuodedangexibaozhuanluzhuangtai，keyifenxibutongzhijianduanbutongzuzhizhongdexibaoyaqunbianhua。zhejiangcongxindejiaoduxindecengcishenrutanjiujibingdefashengfazhanguocheng，weishengmingkexuedeyanjiutansuogengshenjizhi。
4.2擬解決的關鍵科學問題
問題一、病人病灶組織中細胞亞群有哪些種類？
問題二、病人病灶組織中細胞亞群較正常人有哪些變化？
問題三、病人病灶組織中是否有新的亞群和新的標誌基因？
問題四、病人病灶組織中的亞群是怎樣的變化過程？
5.研究方法及技術路線圖
5.1研究方法
• 送樣要求
細胞數量和濃度：建議大於5×105個，濃度為1000個/μL
細胞尺徑：5μm ≤ X ≤ 40μm
細胞活性：活細胞大於90%
細胞懸液不能含有Mg2+和Ca2+等影響酶活性的物質。
單細胞轉錄組高通量測序是基於二代測序平台的基礎上進行的測序，但其整體流程有別於二代測序，如下圖1。
圖1：單細胞轉錄組測序分析流程
5.2技術路線圖
圖2.單細胞轉錄組測序技術路徑
6關鍵技術
6.1 技術原理
將jiang組zu織zhi內nei細xi胞bao分fen離li出chu來lai並bing同tong細xi胞bao標biao簽qian共gong同tong孵fu育yu，然ran後hou對dui帶dai標biao簽qian的de細xi胞bao進jin行xing計ji數shu和he活huo力li檢jian測ce。然ran後hou將jiang單dan個ge細xi胞bao和he磁ci珠zhu進jin行xing孵fu育yu並bing洗xi去qu多duo餘yu的de磁ci珠zhu，進jin而er將jiang細xi胞bao裂lie解jie並bing進jin行xing反fan轉zhuan錄lu和he擴kuo增zeng建jian庫ku，建jian庫ku後hou即ji可ke進jin行xing測ce序xu。對dui含han有you標biao簽qian序xu列lie的de數shu據ju進jin行xing質zhi控kong篩shai選xuan，並bing拆chai分fen數shu據ju為wei每mei個ge細xi胞bao一yi組zu。對dui拆chai分fen後hou的de數shu據ju進jin行xing定ding量liang分fen析xi並bing分fen選xuan出chu不bu同tong的de細xi胞bao亞ya群qun，然ran後hou根gen據ju模mo型xing進jin行xing細xi胞bao軌gui跡ji分fen析xi用yong於yu後hou續xu實shi驗yan探tan究jiu。
6.2 分析內容
圖3.單細胞測序及生物信息分析內容
6.3主要結果展示及意義解讀
（1）低質量細胞過濾：
去除低質量信號的細胞可以較少技術噪音，便於後續生物通路等信號分析。低質量細胞的過濾也包括基因的過濾：去除在任何細胞裏都沒信號的基因、含有極少量reads的細胞及表達量被認為是沒檢測到或洗腦極低的基因，如下圖4所示（圖片來自：https://satijalab.org/seurat/v3.1/pbmc3k_tutorial.html）。
圖4：單細胞測序數據質控分析
（2）主成分分析：
jitizuzhizhongtongchanghanyouduozhongchengfen，erqiebutongchengfenzhijianchangjuxiangguanxing。zaizhezhongqingkuangxiabutongchengfenzhijiandexinxihuiyouzhongdie，shideyangbendefenxibijiaofuza。congzhezhongfuzadeguanxizhongzhongxinzhenghechuwuxiangguandejigezonghedehanyouyangbenjinkenengduoxinxidezhibiao，zhezhongtongjifangfachengweizhuchengfenfenxi。ruxiatu5所示（圖片來自Nature Communication）
圖5：主成分分析
（3）無監督聚類分析：
根(gen)據(ju)主(zhu)成(cheng)分(fen)分(fen)析(xi)的(de)結(jie)果(guo)，對(dui)組(zu)織(zhi)內(nei)的(de)細(xi)胞(bao)進(jin)行(xing)聚(ju)類(lei)分(fen)析(xi)得(de)到(dao)不(bu)同(tong)類(lei)型(xing)的(de)細(xi)胞(bao)群(qun)。可(ke)以(yi)結(jie)合(he)不(bu)同(tong)類(lei)型(xing)細(xi)胞(bao)群(qun)和(he)生(sheng)物(wu)學(xue)理(li)論(lun)推(tui)理(li)程(cheng)病(bing)理(li)進(jin)程(cheng)，如(ru)下(xia)圖(tu)6所示（圖片來自Nature Communication 10.1038/s41467-017-02554-5）
圖6：t-SNE細胞亞群聚類分析
（4）細胞類型注釋：
聚ju類lei後hou的de細xi胞bao群qun被bei認ren為wei不bu同tong的de細xi胞bao類lei型xing，但dan不bu進jin行xing定ding義yi並bing不bu知zhi道dao是shi什shen麼me類lei型xing細xi胞bao。因yin此ci需xu要yao對dui細xi胞bao群qun裏li的de基ji因yin進jin行xing注zhu釋shi並bing結jie合he生sheng物wu學xue知zhi識shi或huo數shu據ju庫ku對dui細xi胞bao群qun進jin行xing定ding義yi，如ru下xia圖tu7所示(圖片來自Science DOI: 10.1126/science.aay3224 )
圖7.細胞類型注釋
（5）細胞亞群再分群分析：
細xi胞bao分fen群qun後hou對dui不bu同tong的de亞ya群qun進jin行xing進jin一yi步bu的de分fen析xi，可ke根gen據ju研yan究jiu目mu的de選xuan擇ze目mu的de細xi胞bao群qun進jin行xing分fen析xi，篩shai選xuan出chu與yu疾ji病bing相xiang關guan的de亞ya細xi胞bao群qun並bing進jin行xing富fu集ji分fen析xi，為wei下xia一yi步bu驗yan證zheng提ti供gong參can考kao，如ru下xia圖tu8所示（圖片來自Science DOI: 10.1126/science.aay3224）
圖8：樹突狀細胞群亞群分析
（6）差異分析:分析正常人和病人樣本細胞群中基因的表達情況，可結合病理分析判斷基因差異與疾病的關係，如下圖9所示。
圖9：差異表達基因分析
（7）細胞間相互作用分析：
在zai組zu織zhi細xi胞bao內nei每mei種zhong細xi胞bao之zhi間jian存cun在zai信xin息xi傳chuan遞di的de作zuo用yong，主zhu要yao以yi配pei體ti和he受shou體ti的de相xiang互hu作zuo用yong相xiang互hu調tiao控kong。而er這zhe些xie配pei體ti受shou體ti的de變bian化hua體ti現xian在zai他ta們men的de基ji因yin表biao達da水shui平ping上shang，因yin此ci根gen據ju數shu據ju庫ku裏li的de信xin息xi可ke以yi分fen析xi有you哪na些xie配pei體ti受shou體ti發fa生sheng了le變bian化hua，從cong而er分fen析xi他ta們men的de調tiao控kong網wang絡luo，如ru下xia圖tu11所示（圖片來自Science DOI: 10.1126/science.aay3224）。
圖11：細胞間相互作用分析
（8）細胞內基因調控網絡分析：
xibaoneijiyinbiaodabianhuahuiyingxiangbaoneiqitaxiangguanjiyindebianhua，congerdaozhixibaobiaoxingdebianhuazuizhongyinqijibingzhengzhuang。zhexiebianhuajiyinzhijiandexianghutiaokongkeyitongguoshengxinfenxidedaotiaokongwangluotu，congerkeshihuadezhanshichuzhexiexianghuzuoyongbianyuhouxufenxiyanjiu，ruxiatu12所示。
圖12：蛋白調控網絡分析
（9）細胞擬時分析：
在zai細xi胞bao分fen化hua時shi細xi胞bao內nei的de基ji因yin表biao達da發fa生sheng變bian化hua，即ji細xi胞bao群qun間jian的de基ji因yin表biao達da會hui發fa生sheng變bian化hua。根gen據ju基ji因yin的de變bian化hua推tui斷duan細xi胞bao群qun是shi怎zen樣yang進jin行xing分fen化hua做zuo一yi個ge擬ni時shi分fen析xi，對dui於yu探tan究jiu疾ji病bing的de發fa展zhan過guo程cheng機ji製zhi極ji為wei重zhong要yao，如ru下xia圖tu13所示（圖片來自doi:10.1136/annrheumdis-2019-215926）
圖13：T細胞分化軌跡分析
（10）KEGG分析：
KEGG分析的關鍵在於擁有完備的數據庫和較完整的Pathway注釋。分析結果中的相關基因是在實際信號通路中存在關係的。相對於GO分析，KEGG分析更為直接的讓研究者可以很好地對於目標基因進行研究。信號通路分析的目的是基於KEGG數據庫去尋找差異翻譯效率基因顯著性富集的信號通路。
每一個Pathway分析的結果需要由三個Sheet來進行結果展示。分別為A1llPathway_Result，AllPathway2Gene以及AllGene2Pathway。這三個部分結果，分別記錄了顯著性Pathway分析情況，每一個Pathway-Term所對應的基因情況以及每一個基因所從屬的Pathway-Term的情況，如下圖14所示。
圖14：差異表達基因KEGG分析
（11）GO分析：
GO分析從細胞的生物學進程（Biological Process）、分子功能（Molecular Function）和細胞組分（Cellular Component）三個層麵對有差異翻譯效率的基因進行功能注釋。GO分析采用Fisher檢驗計算每個GO的顯著性水平(P-Value)，從而篩選出顯著性GO。從生物學意義的角度來看，Biological Process更為貼近表型，往往可以很好地描述樣本的實際情況。Cellular Component往往用於描述基因在細胞上的定位信息，當研究者關注在一些特殊的亞細胞定位研究的時候具有重要的意義。Molecular Function往往用與描述蛋白的實際作用方式，當研究者非常關注整個生物進程中蛋白作用方式的變化時，可以考慮從這個角度切入，如下圖15所示。
圖15：差異表達基因GO分析
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