PAR-CLIP-seq：描繪RNA-蛋白質相互作用圖譜
項目簡介
PAR-CLIP-seq（Photoactivatable Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and lmmunoprecipitation sequencing）即基於光活化核糖核苷的交聯和免疫沉澱測序技術[1]，將具有光活性的核糖核苷類似物4sU摻入到新轉錄的RNA中，再通過分析堿基T-C轉換位點，可在全轉錄組範圍內研究RNA與蛋白的相互作用，揭示靶向RBP的RNA結合位點。
技術優勢
1.紫外交聯效率高，是CLIP-seq的100~1,000倍
2.分辨率高，定位到結合位點
3.特異性高
技術應用
1.鑒定全轉錄組RNA與蛋白質直接結合位點
2.揭示全轉錄組RNA—蛋白質相互作用
送樣要求
≥3*107個細胞/樣本
樣本類型：活細胞
Ribo-seq 技術流程[2]
技術原理
將具有光活性的核糖苷類似物4sU插入到活細胞的新生RNA轉錄本中，在365nm紫外燈輻射的細胞中4sU標記的RNA被誘導與RBP相互作用；免疫共沉澱所要的RBP，然後分離被交聯和共沉澱的RNA。RNA隨即被轉換成cDNA文庫並且進行深入測序。4sU的處理令交聯的序列產生T-C的轉變，因此通過PAR-CLIP所準備的cDNA文庫能夠準確的定位交聯的位置。
分析內容
1.原始數據質控、過濾
2.參考基因組比對
3.Peak calling
4.Peak注釋
5.GO富集分析5.KEGG富集分析
6.Motif分析
7.信號矩陣分析（Peak熱圖）
8.CIMS 分析
9.可視化文件
10.差異分析（若有多組樣品可找出差異結合位點）
圖1. IGV峰圖
結果示例
圖2. Motif分析[2]
圖3. 信號分布熱圖
圖4. CIMS分析突變頻率[3]
圖5. PAR-CLIP-seq結果顯示 PRRC2B -mRNA相互作用
案例：
NAR：RNA 結合蛋白 PRRC2B 介導特定 mRNA 的翻譯並調節細胞周期進程[4]
越來越多的證據表明，基因表達的轉錄後控製，包括 RNA 剪接、運輸、修飾、翻譯和降解，主要依賴於 RNA 結合蛋白 (RBP)。然而，許多 RBP 的功能仍未得到充分研究。此研究中鑒定了一種新 RBP——PRRC2B的功能。通過PAR-CLIP-seq，研究者在HEK293T 細胞中一組特定 mRNA上的翻譯起始密碼子附近鑒定了全轉錄組富含 CU-或 GA 的 PRRC2B 結合位點。後續通過更多的機製研究表明， PRRC2B 對於有效翻譯細胞周期進程和細胞增殖所需的特定蛋白質至關重要。
參考文獻
[1]PAR-CLIP (Photoactivatable Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and lmmunoprecipitation): a step-by-stepprotocol to the transc riptome - wide identification of binding sites of RNA-binding proteins. Methods Enzymol.2014:539:113-61
[2]Hou L, Wei Y, Lin Y, et al. Concurrent binding to DNA and RNA facilitates the pluripotency reprogramming activity of Sox2. Nucleic Acids Res 2020 Apr 17;48(7)
[3]Ransey E, Björkbom A, Lelyveld VS, et al. Comparative analysis of LIN28-RNA binding sites identified at single nucleotide resolution. RNA Biol 2017 Dec 02;14(12)
[4]Jiang F, Hedaya OM, Khor E, et al. RNA binding protein PRRC2B mediates translation of specific mRNAs and regulates cell cycle progression. Nucleic Acids Res 2023 Jun 23;51(11)